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熒光入門介紹

更新時(shí)間:2024-01-15      點(diǎn)擊次數(shù):658

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熒光是George Gabriel Stokes于1852年shouci報(bào)道的一種現(xiàn)象。他觀察到螢石在紫外線照射后開始發(fā)光。熒光是光致發(fā)光的一種形式,是指一種材料被光照射后會發(fā)射出光子。發(fā)射光的波長比激發(fā)光更長。這種效應(yīng)又稱為斯托克斯位移。



以熒光為工具在顯微鏡中的應(yīng)用


熒光在顯微鏡中有著廣泛的應(yīng)用,是觀察特定分子分布的重要工具。細(xì)胞中的絕大多數(shù)分子并不會發(fā)出熒光,因此必須用熒光分子即所謂的熒光素進(jìn)行標(biāo)記。對于感興趣的分子可以直接標(biāo)記(例如,用DAPI標(biāo)記DNA),或者使用可與特異性抗體偶聯(lián)的熒光素進(jìn)行免疫染色。免疫染色時(shí)通常必須對細(xì)胞進(jìn)行固定。

熒光顯微鏡還可對活細(xì)胞或組織進(jìn)行延時(shí)成像。為此,對于感興趣的蛋白質(zhì)可以使用基因編碼的熒光分子進(jìn)行標(biāo)記,如GFP(綠色熒光蛋白)。對于感興趣的分子(如Ca2+)還可以使用可逆結(jié)合的合成染料(如fura-2)或轉(zhuǎn)基因天然蛋白質(zhì)(如GFP衍生物)進(jìn)行標(biāo)記。

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圖1:當(dāng)特定波長(激發(fā)波長)的光照射到分子上(例如照射到熒光團(tuán)中)時(shí),光子會被分子的電子吸收。然后,電子從它們的基態(tài)(S0)提升到更高的能級,即激發(fā)態(tài)(S1’)。這個(gè)過程被稱為激發(fā)(1)。激發(fā)態(tài)壽命很短(通常為10-9/-10-8秒),在此期間電子的一些能量會丟失(2)。當(dāng)電子離開激發(fā)態(tài)(S1)返回基態(tài)(3)時(shí),它們會失去在激發(fā)過程中獲得的剩余能量。熒光團(tuán)的獲得的能量會以光子形式釋放,釋放的光子波長以比激發(fā)光波長更長,從而能量更少。這種現(xiàn)象被稱為斯托克斯位移。



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圖2:COS 7細(xì)胞,綠色:無特征蛋白質(zhì),GFP,紅色:α-微管蛋白,Cy3,藍(lán)色:細(xì)胞核,DAPI。感謝中國上海SIBS、CAS、生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所邊瑋提供的圖片。


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圖3:小鼠成纖維細(xì)胞,綠色:F-肌動蛋白,F(xiàn)ITC,紅色:微管蛋白,Cy5,藍(lán)色:細(xì)胞核,DAPI。感謝德國海德堡Max Planck醫(yī)學(xué)研究所Günter Giese博士提供的圖片。


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圖4:小鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞,藍(lán)色:轉(zhuǎn)染細(xì)胞標(biāo)記;綠色:肌動蛋白,TRITC;紅色:GluA Ampa受體單位,Texas Red;灰色:突觸小泡蛋白,Cy 5


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圖5:果蠅幼蟲,綠色:RNA結(jié)合蛋白,Alexa 488

磷光的機(jī)制原理

由于磷光分子發(fā)光的時(shí)間比熒光素長得多,因此它們儲存激發(fā)能量的方式肯定有所不同。這種差異的基礎(chǔ)在于兩種形式的激發(fā)能級,即單重激發(fā)態(tài)和三重激發(fā)態(tài)都基于不同的自旋排列。

自旋是電子的一種屬性。簡單來說,自旋描述了由電子旋轉(zhuǎn)引起的角動量。電子的自旋方向可以是正方向(+1/2),也可以是負(fù)方向(?1/2)。更高能級的自旋配對可以在相互方向上平行或反平行。在反平行自旋配對中,單個(gè)角動量相互補(bǔ)償,同時(shí)自旋總值為零。這種自旋排列就稱為單重態(tài)。兩種平行自旋互不補(bǔ)償且所得數(shù)值不同于零值,在這種情況下,自旋被稱為三重態(tài)。

當(dāng)電子從單重態(tài)激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí),就會產(chǎn)生熒光。但在某些分子中,被激發(fā)電子的自旋可以在一種稱為系統(tǒng)間交叉的過程中轉(zhuǎn)換為三重態(tài)。這些電子失去能量,直到它們處于三重基態(tài)。這種態(tài)比基態(tài)具有更高的能量,但也比單重態(tài)激發(fā)態(tài)具有更低的能量。因此,電子無法切換回單重態(tài),也不能輕易地返回基態(tài),因?yàn)榱孔恿W(xué)只允許自旋總值為零。因此分子被困在其能量狀態(tài)當(dāng)中。

但從三重基態(tài)到基態(tài)的一些變化有時(shí)還是有可能的。這些變化會發(fā)射出光子和磷光。由于一次只有少數(shù)事件可能發(fā)生,三重基態(tài)呈現(xiàn)為能量儲庫的形式,因此能夠在更長的一段時(shí)間內(nèi)發(fā)出磷光。

冷發(fā)光在顯微鏡中的應(yīng)用

對于顯微鏡,熒光是最為實(shí)用的一種冷發(fā)光。熒光素可以很容易地通過特定的光源(如燈和濾光系統(tǒng)或激光器)在特定波長下激發(fā),發(fā)射光和激發(fā)光可以通過波長來加以區(qū)分(斯托克斯位移)。

利用熒光成像,實(shí)驗(yàn)室人員可以對細(xì)胞內(nèi)的分子數(shù)量和位置進(jìn)行特征描述。熒光顯微鏡的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)使用幾種熒光素。熒光素只需其激發(fā)和發(fā)射波長不同即可。因此,不同目標(biāo)分子均可同時(shí)觀察并開展大量的實(shí)驗(yàn),例如開展共定位的研究等。


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圖6:果蠅,幼蟲齡期,綠色:Feb211陽性神經(jīng)元及其軸突,Alexa 488;紅色:CNS纖維部分(即所有軸突),Cy3;藍(lán)色:細(xì)胞核,DAPI。感謝德國Eggenstein-Leopoldshafen毒理學(xué)與遺傳基因研究所,Karlsruhe研究所Christoph Melcher博士提供的圖片。


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圖7:小鼠腎臟切片,綠色:腎小球和腎曲小管,Alexa 488 WGA;紅色:F-肌動蛋白(普遍存在于腎小球和刷狀緣);藍(lán)色:細(xì)胞核,DAPI


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圖8:新生心肌細(xì)胞,黃色:DNA,DAPI;綠色:肌間蛋白,Cy3;紅色:鈣粘蛋白,Texas Red;藍(lán)色:肌動蛋白,Alexa 633


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圖9:熒光顯微鏡下獲得的分裂中期FISH染色染色體。感謝東京大學(xué)前沿科學(xué)研究生院人類進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室Yumiko Suto博士提供的圖片。

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