熒光過程提供了兩個(gè)用于成像的測(cè)量參數(shù)：強(qiáng)度和熒光壽命。熒光壽命是指分子停留在激發(fā)態(tài)的時(shí)間?？梢酝ㄟ^觀察足夠大量的激發(fā)-發(fā)射事件集合來測(cè)量熒光染料的典型壽命。我們可以測(cè)量圖像中所有像素的典型壽命，并將這些數(shù)字記入數(shù)組元素。那就是熒光壽命成像^[1](FLIM，也稱為τ-映射）。典型的熒光壽命范圍在0.2到20納秒之間。

熒光壽命與熒光染料的濃度無關(guān)。無論樣品結(jié)構(gòu)僅有零星熒光染料還是載滿熒光染料：壽命信號(hào)始終相同，并表明在同一環(huán)境中存在相同的熒光染料。因此，熒光壽命不受光漂白的影響。樣品深處的圖像將比表面圖像暗得多——但壽命并沒有改變。這是壽命測(cè)定的主要優(yōu)勢(shì)。

如果分子環(huán)境刺激激發(fā)態(tài)衰變而不發(fā)射光子，則熒光強(qiáng)度會(huì)降低（淬滅）。熒光淬滅是一條單獨(dú)的發(fā)射路徑，因此在動(dòng)力學(xué)上與熒光過程形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。激發(fā)態(tài)存儲(chǔ)現(xiàn)在可以通過一個(gè)以上的過程衰變，從而縮短熒光壽命。這種壽命的改變可用于收集分子環(huán)境的信息。

一種特殊類型的淬滅是將激發(fā)能量以非輻射的方式傳遞到相鄰的不同熒光染料中：“熒光共振能量轉(zhuǎn)移"^[2]，FRET。此時(shí)，不僅第一個(gè)熒光染料（供體）變暗，壽命變短，而且第二個(gè)熒光染料（受體）在“錯(cuò)誤的"激發(fā)顏色下開始發(fā)光。由于這種效果的產(chǎn)生需要兩種熒光染料（小于10 nm）的密切接觸，因此將其用作研究分子相互作用的“分子標(biāo)尺"。它也是許多現(xiàn)代FRET生物傳感器的基礎(chǔ)，專門用于測(cè)量活體樣本中的各種細(xì)胞內(nèi)參數(shù)：Ca2+或其他離子濃度追蹤、酸堿度、極性和電位測(cè)量、蛋白質(zhì)相互作用等。

FLIM的黃金標(biāo)準(zhǔn)是“時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)"^[3]TCSPC，它與多光子共聚焦顯微鏡兼容。用光脈沖照射樣本，測(cè)量發(fā)射光子到達(dá)的時(shí)間。為重建典型的壽命，這種測(cè)量要在同一樣本位置重復(fù)幾次。需要測(cè)量幾百個(gè)事件才能達(dá)到大約10%的準(zhǔn)確度。然后將數(shù)據(jù)按時(shí)間分組放入直方圖中。然后對(duì)該直方圖中隨時(shí)間出現(xiàn)的衰變進(jìn)行數(shù)學(xué)擬合，并直接提供所需的熒光壽命（圖01a-c）。

這個(gè)過程是zuijing確的，并可以重復(fù)，但需要一定時(shí)間。測(cè)量后，系統(tǒng)在大約100納秒的死區(qū)時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)備好進(jìn)行下一次發(fā)射。要錄入400個(gè)事件，測(cè)量一個(gè)像素的時(shí)間達(dá)40微秒。一張512x512的圖像大約需要12秒，這無法適應(yīng)快速變化和移動(dòng)的生命系統(tǒng)。

目前的解決方案需要一定的技術(shù)靈活性、復(fù)雜的手動(dòng)數(shù)據(jù)處理和jing密的評(píng)價(jià)程序。

徠卡顯微系統(tǒng)推出了一款FLIM顯微鏡：FALCON（FAst Lifetime CONtrast）熒光壽命成像系統(tǒng)可以解決以上所有問題。

本系統(tǒng)基于混合探測(cè)器（HyD）^[4]，是理想的壽命成像傳感器，具有極短的死區(qū)時(shí)間。激光脈沖序列和發(fā)射光子脈沖都以高采樣率即刻實(shí)現(xiàn)數(shù)字化，將測(cè)得的距離直接輸入數(shù)據(jù)池。這些到達(dá)時(shí)間用于輸出“快速-FLIM"圖像。

新方法允許使用大多數(shù)激光脈沖，并應(yīng)用一個(gè)過濾器來限制只有一個(gè)光子發(fā)射的脈沖事件。在第一個(gè)光子到達(dá)后不久，隨即到達(dá)的光子不可避免的會(huì)被忽略，可以通過智能數(shù)學(xué)方法進(jìn)行校正?；谝陨戏N種因素，圖像記錄速度提高了10倍。

所有FALCON FLIM成像均集成在共聚焦顯微鏡中。記錄FLIM就像激活一個(gè)額外的通道。用于3D、時(shí)間和光譜系列的多維采集模式可立即用于FLIM成像。例如標(biāo)題圖像：具有經(jīng)典組織學(xué)染色的小鼠胚胎。使用NAVIGATOR軟件，創(chuàng)建了722個(gè)圖塊，每個(gè)圖塊為512x512像素的圖稿。原始圖像有1.9億像素。用四個(gè)指數(shù)對(duì)壽命進(jìn)行擬合，并以顏色進(jìn)行編碼。

在功能成像領(lǐng)域，我們希望監(jiān)測(cè)小分子、離子或電勢(shì)的動(dòng)態(tài)變化。這通常是用熒光探針完成的。其中多數(shù)顯示出強(qiáng)度和壽命的變化。也可以用熒光蛋白裝飾蛋白質(zhì)，并在活細(xì)胞中表達(dá)這些構(gòu)建體。該技術(shù)利用FRET跟蹤活細(xì)胞中的分子相互作用。最為現(xiàn)代化的工具是蛋白質(zhì)或肽，它們與所需的分析物（例如Ca2+）結(jié)合，并裝飾有一對(duì)進(jìn)行FRET的熒光蛋白。結(jié)合分析物后，肽將發(fā)生構(gòu)象變化，F(xiàn)RET將出現(xiàn)或消失。這些探針被稱為FRET-生物傳感器。生物傳感器的一種是利用cAMP結(jié)合蛋白Epac^[5]。

FALCON的技術(shù)速度夠快，可以在活細(xì)胞中使用化學(xué)傳感器和FRET生物傳感器進(jìn)行熒光壽命成像。

無染色應(yīng)用是分析活體材料中的內(nèi)源性熒光。例如：癌細(xì)胞抑制細(xì)胞呼吸，傾向于無氧糖酵解（瓦博格效應(yīng)），這會(huì)導(dǎo)致積累更高濃度的熒光NADH^[6]。即使沒有活檢，多光子顯微鏡也能在皮膚組織中進(jìn)行深度成像。同樣，壽命對(duì)比度要可靠得多，因?yàn)樯顚拥娘@微鏡會(huì)受到吸收和陰影效應(yīng)的影響，從而使強(qiáng)度信號(hào)失真。

傳統(tǒng)意義上，不同的熒光染料以其不同的顏色來區(qū)分。如果激發(fā)和發(fā)射相同，仍然可以通過壽命進(jìn)行區(qū)分。發(fā)射強(qiáng)度和壽命可以作為顏色的函數(shù)獨(dú)立記錄。因此，可見熒光染料的數(shù)量是發(fā)射光譜和擬合壽命的乘積。

STELLARIS 8 FALCON FLIM熒光壽命成像顯微鏡

參考文獻(xiàn)：

1.Gerritsen et al: Fluorescence Lifetime Imaging in Scanning Microscopy. Pawley J (Ed) Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd ed. Springer New York (2006)

2.F?rster T: Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann. Physik. 437, p 55 (1948)

3.Becker W: Fluorescence lifetime imaging – techniques and applications. J. Microscopy 247/2, pp 119-136 (2012)

4.Borlinghaus RT, Birk H & Schreiber F: Detectors for Sensitive Detection: HyD. In: Mendez-Vilas A (ed.): Current microscopy contributions to advances in science and technology, Formatex Vol. 5, 818-825 (2012)

5.Ponsioen B et al: Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO reports 5/12 pp 1176-1180  (2004)

6.Georgakoudi I et al: NAD(P)H and Collagen as in Vivo Quantitative Fluorescent Biomarkers of Epithelial Precancerous Changes. Cancer Research 62, 682– 687 (2002)